液相色譜工作流程

無論正在利用何種相互作用，液相柱色譜法都分六個步驟進(jìn)行：

柱平衡

樣品裝載

洗滌

洗脫

清洗

色譜柱再生

         一、柱平衡：

        大多數(shù)液相色譜方案從樹脂平衡步驟開始。與目標(biāo)蛋白質(zhì)和所選樹脂相容的緩沖液通過柱子。一種常見的做法是用 5-10 柱體積 (CV) 的平衡緩沖液平衡柱。例如，蛋白質(zhì)與疏水相互作用樹脂的結(jié)合在高離子強(qiáng)度下有效。

         在選擇平衡緩沖液時也要考慮目標(biāo)蛋白質(zhì)的特性，因為離子強(qiáng)度等緩沖液因素會受到蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的限制；通常，人們會避免使用會使感興趣的蛋白質(zhì)變性或阻止其與固定相相互作用的平衡緩沖條件。

        二、樣品加載：

         平衡后，將樣品加載到色譜柱上。樣品通常加載在與平衡緩沖液組成相同的緩沖液中，以最大限度地提高蛋白質(zhì)與固定相的相互作用。

         樣品可以手動上樣或使用樣品泵。某些類型的色譜法會限制可加載到色譜柱上的樣品體積。另一個重要的上樣考慮因素是大多數(shù)樹脂結(jié)合蛋白質(zhì)的能力有限。上樣過多導(dǎo)致色譜柱過載會對分離產(chǎn)生不利影響。

          樣品過載會影響色譜柱柱效，色譜柱受到污染不僅影響柱效更會降低使用壽命。在柱前安裝保護(hù)柱可以有效保護(hù)分析柱免受污染。恒譜生色譜保護(hù)柱能過濾所有顆粒，積累非特定吸附材料，還將延長在微堿性pH下使用的分析主柱的壽命。

        三、洗柱：

        一旦蛋白質(zhì)被固定在固定相上，只與樹脂微弱或非特異性相互作用的蛋白質(zhì)通過用幾柱體積的洗滌緩沖液洗滌柱子來去除。這種洗滌緩沖液可以具有與平衡緩沖液相同的成分或包含破壞弱特異性相互作用的成分。

       例如，固定化金屬親和層析 (IMAC) 用高濃度的咪唑洗脫與樹脂結(jié)合的蛋白質(zhì)。一種常見的做法是使用包含中等濃度咪唑的洗滌緩沖液，以消除僅與樹脂微弱結(jié)合的污染蛋白質(zhì)。洗滌液相色譜柱子直到在洗脫液中檢測不到蛋白質(zhì)。當(dāng)使用帶有 UV 檢測器的色譜系統(tǒng)時，洗滌色譜柱直到 280 nm 吸收讀數(shù)回到基線。

          四、樣品洗脫：

          在所有非特異性和弱相互作用的蛋白質(zhì)都從樹脂上洗掉后，通過改變通過樹脂的緩沖液的組成，與樹脂強(qiáng)烈相互作用的蛋白質(zhì)會從柱子上洗脫下來。在離子交換色譜中，蛋白質(zhì)用高離子強(qiáng)度的緩沖液或通過改變 pH 值來洗脫，以破壞固定目標(biāo)蛋白質(zhì)的靜電相互作用。相反，與疏水相互作用樹脂結(jié)合的蛋白質(zhì)通過降低緩沖液的離子強(qiáng)度來洗脫。在親和層析中，蛋白質(zhì)通常通過引入競爭配體或通過切割親和標(biāo)簽從柱中洗脫，也可以使用高鹽緩沖液或改變 pH 值進(jìn)行洗脫。其他洗脫方案可能涉及混合不同極性的溶劑以調(diào)整流動相中每種組分的溶解度。

          洗脫條件可以線性梯度方式或逐步方式改變。通常，選擇梯度洗脫方案（其中流動相的組成隨時間線性變化）來確定洗脫曲線和使感興趣的蛋白質(zhì)從樹脂中釋放出來的洗脫緩沖液濃度。一旦確定了該濃度，為了節(jié)省時間，可以設(shè)計一個逐步等度洗脫方案，其中流動相的組成在每一步都是恒定的，可以設(shè)計用于未來的純化。

           注意：尺寸排阻色譜不需要更換緩沖液，因為它不依賴于流動相和固定相之間的特定相互作用。沒有真正的洗滌和洗脫步驟，因為 SEC 僅依賴于大分子被多孔珠延遲的事實，而小分子以最小的樹脂相互作用通過樹脂。

           五、清洗：

            在目標(biāo)蛋白質(zhì)從樹脂中洗脫后，任何與樹脂結(jié)合的蛋白質(zhì)都將通過增加洗脫緩沖液的強(qiáng)度進(jìn)行洗脫。此步驟允許色譜柱重復(fù)用于將來的分離。

            六、色譜柱再生：

          在剝離與介質(zhì)結(jié)合的剩余化合物后，柱子要么用平衡緩沖液飽和以供后續(xù)重復(fù)使用，要么用存儲緩沖液填充。