高效液相色譜法檢測類胡蘿卜素

一、什么是類胡蘿卜素：

       類胡蘿卜素是自然界中廣泛存在的黃色、橙紅色或紅色多烯物質(zhì)。它們是在胡蘿卜中發(fā)現(xiàn)的，因此得名。人體不能合成類胡蘿卜素，因此主要通過食物獲得。水果和蔬菜是類胡蘿卜素的主要食物來源。

       類胡蘿卜素由8個類異戊二烯單元組成，根據(jù)分子組成可分為胡蘿卜素和葉黃素兩大類。前者只含有烴和氫兩種元素，而后者是前者的含氧衍生物，含有一個或多個氧原子形成羥基、羰基、甲氧基和環(huán)氧化合物。類胡蘿卜素最重要的代表是β-胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素、玉米黃質(zhì)、蝦青素和斑蝥素。

       二、類胡蘿卜素的作用：

       膳食類胡蘿卜素是維生素的前體，可預(yù)防多種慢性退行性疾病。類胡蘿卜素分析對于了解它們對人類健康的重要性是必要的。然而，現(xiàn)有的用于分離主要類胡蘿卜素的高效液相色譜 (HPLC) 方法需要更長的分析時間，并且不能充分分離紫黃質(zhì)和新黃質(zhì)。

      類胡蘿卜素的一些特性，例如它們在自然界中的存在、不同的濃度、對異構(gòu)化的敏感性以及高度不飽和類胡蘿卜素的氧化，使得單個類胡蘿卜素的量化成為一項(xiàng) 具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。在分析類胡蘿卜素時，需要采取預(yù)防措施以盡量減少異構(gòu)化、氧化和降解。

       三、分離方法：

       已經(jīng)采用了多種方法來檢測食品樣品中的類胡蘿卜素，從薄層色譜到高壓液相色譜 (HPLC) 以及 HPLC 與包括 MALDI-TOF 在內(nèi)的質(zhì)譜相結(jié)合。鑒定和定量類胡蘿卜素多用的方法是利用 HPLC 與紫外-可見吸收檢測相結(jié)合。

       雖然使用正相和反相HPLC都可以進(jìn)行類胡蘿卜素的分離，但是由于非極性類胡蘿卜素的分離較差，正相HPLC不適用于類胡蘿卜素的分離。相比之下，反相 HPLC 能夠顯著增加分析物和非極性固定相之間的相互作用，從而提高類胡蘿卜素的分離度。

       四、C18色譜柱：

       在這些色譜柱中，等度或梯度模式的 C18 色譜柱是類胡蘿卜素分離的一種選擇。與 HPLC 相比，UHPLC 具有多項(xiàng)優(yōu)勢，例如更高的峰容量、更小的峰寬、更高的靈敏度和更高的色譜分離度。更短的分析時間也大大節(jié)省了流動相溶劑。

        USHA C18-G色譜廣泛用于分析極性物質(zhì)和疏水性物質(zhì)，是集耐久性、良好峰形顯示和重現(xiàn)性特別于一身的ODS柱。由于 C30 固定相色譜柱無法用于 UHPLC，因此 C18 色譜柱已被用于類胡蘿卜素分離，盡管 C18 柱對類胡蘿卜素異構(gòu)體的分離度較差。

        五、提取方法：

（根據(jù)各種類胡蘿卜素在提取溶劑中的溶解度和穩(wěn)定性確定具體方法）

固相萃取 (SPE)

液液萃取

超臨界流體萃取 (SFE)

基質(zhì)固相分散 (MSPD)

皂化

測定方法：紫外/可見分光光度法

高效液相色譜法（此類方法是分離、鑒定和定量食品和生物樣品中類胡蘿卜素的一種方法）

       分析 HPLC 類胡蘿卜素的檢測器是光電二極管陣列 (PDA)，但也可以使用電化學(xué)檢測器 (ECD)、熒光檢測器、質(zhì)譜檢測器 (MS) 和核磁共振 (NMR) 等檢測器。

       六、流動相：

       類胡蘿卜素分離的優(yōu)化需要進(jìn)樣溶劑和流動相的相容性。理想情況下，進(jìn)樣溶劑應(yīng)與流動相相容或比反相極性更強(qiáng)，以提供樣品的柱上濃度。如果類胡蘿卜素在進(jìn)樣溶劑中比在流動相中更易溶解，特別是當(dāng)溶液接近飽和時，進(jìn)樣時類胡蘿卜素會沉淀，導(dǎo)致峰拖尾?；蛘?，它們會在通過色譜柱時保留在進(jìn)樣溶劑中，從而產(chǎn)生寬帶和雙峰 。另一方面，如果進(jìn)樣溶劑太弱，樣品將不會*溶解在流動相中。

       樣品和溶劑過濾可防止小容量進(jìn)樣器接頭堵塞、劃傷和泄漏?；芈坊驈U液管路堵塞會導(dǎo)致高背壓和回路填充困難。位于閥進(jìn)樣器和色譜柱之間以減少譜帶展寬的低死體積接頭也容易堵塞。導(dǎo)致 HPLC 問題的其他因素包括不匹配或損壞的進(jìn)樣器組件、可變的樣品量、泄漏和增加的系統(tǒng)壓力。通過過濾，經(jīng)過適當(dāng)調(diào)整和清潔的注射器應(yīng)持續(xù) 5,000 次注射。

       選擇合適的過濾器需要了解過濾器/溶劑的兼容性以及過濾器的化學(xué)/物理特性。恒譜生建議客戶選擇多階不銹鋼進(jìn)樣口過濾器，配套用于外徑1/8英寸或1/16英寸的管子，放置于流動相溶劑瓶中，過濾雜質(zhì)。

       選擇不正確的過濾器可能會導(dǎo)致可萃取物質(zhì)危及分析結(jié)果。對于色譜分析，由可萃取材料引起的情況包括樣品吸收、共流出和外來峰。