您不可不知的反相 hplc 流動(dòng)相的選擇

       在 HPLC 中，流動(dòng)相是純?nèi)軇┗蚧旌先軇┮约皫в泄腆w改性劑的溶劑。色譜工作者可以針對(duì) HPLC 的不同應(yīng)用在數(shù)百種溶劑中進(jìn)行選擇。特定的選擇通常受溶劑特性的影響，例如粘度、折射率、非腐蝕性、毒性、混溶性、透明度等。以合理的價(jià)格以足夠的純度商業(yè)供應(yīng)也是重要因素。流動(dòng)相中的溶劑強(qiáng)度或有機(jī)溶劑百分比控制分析物的保留時(shí)間。

一、什么是流動(dòng)相？

      流動(dòng)相是使分析物通過色譜柱的溶劑。分析物存在于適當(dāng)?shù)娜軇┲?，在樣品制備后注入色譜系統(tǒng)。該溶劑不被視為新基質(zhì)，因?yàn)樗粫?huì)干擾分析。可以在樣品制備過程中選擇分析物的載體（溶劑）的性質(zhì)，以滿足特定要求，例如揮發(fā)性和與 HPLC 中流動(dòng)相的混溶性。在反相色譜柱中，流動(dòng)相比固定相更具極性。一般來說是選擇極性流動(dòng)相，因?yàn)榉蛛x表現(xiàn)出更好的重現(xiàn)性。

       分析物在流動(dòng)相中的溶解度在色譜柱選擇中也起著重要作用。對(duì)于溶于水或部分水性溶劑的化合物，選擇反相 HPLC 不是問題，但對(duì)于不溶于極性溶劑的化合物，通常需要使用正相色譜柱。樣品極性、固定相極性和流動(dòng)相極性的評(píng)估對(duì)于色譜柱的選擇也很重要。

二、流動(dòng)相的一般選擇要求： 

1.純度：所有溶劑都應(yīng)具有最高的純度和質(zhì)量。HPLC 級(jí)溶劑經(jīng)過預(yù)過濾和純化，在紫外線下具有最小的吸光度。因此，它們不含會(huì)在色譜圖基線中產(chǎn)生假峰的雜質(zhì)。緩沖液制備中使用的水具有最高純度。去離子水通常含有痕量有機(jī)化合物，因此不推薦用于HPLC。

2.粘度：為了保持可接受的壓降 (< 2500 psi) 和合理的流過HPLC色譜柱的流速，流動(dòng)相粘度應(yīng)盡可能低。較低粘度的流動(dòng)相產(chǎn)生較窄的色譜峰。例如乙腈通常是反相 HPLC 的溶劑，因?yàn)樗粌H粘度低于甲醇或異丙醇，而且具有良好的保留特性。 

3.沸點(diǎn)：如果涉及樣品回收，沸點(diǎn)很重要，低沸點(diǎn)溶劑更容易從樣品中去除。 

4.無腐蝕性：溶劑必須對(duì) HPLC 系統(tǒng)組件無腐蝕性。

5.毒性：現(xiàn)在每個(gè)人都關(guān)心與實(shí)驗(yàn)室化學(xué)品相關(guān)的健康和安全風(fēng)險(xiǎn)。四氫呋喃可用作不穩(wěn)定或穩(wěn)定的流動(dòng)相。不穩(wěn)定的版本如果蒸發(fā)可能有爆炸危險(xiǎn)，并且在不儲(chǔ)存在氮?dú)庀聲r(shí)容易分解。穩(wěn)定版本在用于檢測(cè)的典型紫外線波長(zhǎng)下具有高紫外線吸收率。

6.混溶性：并非所有HPLC溶劑都可混溶。如果混合了不混溶的溶劑可能會(huì)導(dǎo)致一些問題，例如不穩(wěn)定的基線、波動(dòng)的壓力、高壓等。異丙醇可與大多數(shù)常見的 HPLC 溶劑混溶。因此，在不確定最后使用的溶劑系統(tǒng)的情況下，它可以用來沖洗 HPLC 的流路。 

透明度（UV 截止）：流動(dòng)相（無樣品）必須在用于檢測(cè)的波長(zhǎng)下充分傳輸。一項(xiàng)研究表明，流動(dòng)相吸光度在檢測(cè)波長(zhǎng)處通常應(yīng)小于0.5。 

三、流動(dòng)相制備：

      預(yù)混：流動(dòng)相預(yù)混合是通過分別測(cè)量每種溶劑的體積并將它們合并到溶劑容器中來完成的。當(dāng)有機(jī)溶劑與水混合時(shí)，會(huì)出現(xiàn)負(fù)混合體積。例如，準(zhǔn)備1升的甲醇/水 (50:50)，在量筒中分別量取 500 毫升的甲醇和水，然后將它們混合在一起。由于溶劑在混合時(shí)會(huì)收縮，因此不宜將500毫升甲醇倒入1升容量瓶中并用水定容，因?yàn)樾枰^ 500 毫升的水。

      緩沖：含有酸性或堿性分析物的樣品需要在流動(dòng)相中加入緩沖液。pH 調(diào)節(jié)應(yīng)單獨(dú)在水性緩沖液中進(jìn)行，即在將其與任何有機(jī)溶劑混合之前進(jìn)行。應(yīng)采取預(yù)防措施以防止緩沖沉淀的任何可能性。甲醇可與大多數(shù)緩沖液混溶。當(dāng)磷酸鹽緩沖液與乙腈 混合時(shí)，上限應(yīng)為60-80% ACN，磷酸鹽緩沖液的濃度應(yīng)小于 15mM 以防止沉淀。2.5至3的酸性pH值是大多數(shù)制藥應(yīng)用的良好起點(diǎn)。這是由于大多數(shù)酸性分析物的電離受到抑制以及堿性分析物與硅膠基色譜柱上表面硅醇的相互作用最小。用于流動(dòng)相制備的常見酸有磷酸、甲酸和乙酸。在整個(gè)梯度運(yùn)行過程中，緩沖添加劑的濃度必須保持恒定。通常建議在流動(dòng)相的水相和有機(jī)相中使用相同濃度的 TFA 或其他酸（吸收紫外線）以抑制梯度運(yùn)行期間任何類型的基線偏移。

       另外，選擇合適的流動(dòng)相吸濾頭（又稱溶劑進(jìn)樣口過濾器)可有效濾除流動(dòng)相中的固體顆粒雜質(zhì)，但未經(jīng)過濾的溶劑或溶劑瓶中生長(zhǎng)的微生物都會(huì)降低溶劑入口過濾頭的壽命和泵的性能，因此，需要定期清洗或更換溶劑進(jìn)樣口過濾器。

       今天恒譜生分享的知識(shí)先到這啦，希望對(duì)您的工作有所幫助！